GENEQUALITY AB-THROMBO TYPE PLUS

Descrizione

Il kit GENEQUALITY AB-THROMBO TYPE PLUS è un IVD indicato per l’identificazione simultanea delle mutazioni G20210A del gene codificante per Fattore II, G1691A/Leiden e H1299R del Fattore V, C677T e A1298C di MTHFR e del polimorfismo 5G/4G per PAI-1 mediante Reverse Line Blot (RLB).

Caratteristiche rilevanti

• Per l’esecuzione del saggio sono sufficienti 2 µL di DNA estratto
• Può essere utilizzato, nel formato per automazione, su diversi strumenti automatici per protocolli Reverse Line Blot

Contenuto del kit

Il kit include:

• Reagenti pronti all’uso per l’amplificazione
• DNA di riferimento
• Strip e reagenti per la visualizzazione degli amplificati mediante Reverse Line Blot
• Lucido per la lettura della strip e l’interpretazione dei risultati
• Foglio archivio strip
• Vassoietti con 8 canali monouso per lo sviluppo Reverse Line Blot (solo per il formato manuale)

Approfondimento

La trombosi venosa consiste nell’impedimento della circolazione causato da coaguli formatisi localmente nella vena o rilasciati da un trombo originatosi in altra sede. I siti in cui si formano più comunemente i trombi sono le vene superficiali e profonde delle gambe, ma possono formarsi anche nelle vene del cervello, della retina, del fegato e del mesentere.
Un argomento dibattuto è se il rischio di formazione dei trombi sia prevedibile. Oltre ai fattori locali che causano attivazione del sistema di coagulazione quali traumi, chirurgia, immobilizzazione, gravidanza e l’uso di contraccettivi orali, anche il background genetico dell’individuo può giocare un ruolo importante. La presenza di mutazioni a livello dei geni codificanti le proteine coinvolte nel processo emostatico o fibrinolitico può determinare un aumento del rischio di trombosi venosa durante tutta la vita.
Ad oggi sono state identificate numerose mutazioni responsabili dello sviluppo della trombosi venosa: mutazioni nel gene codificante per il Fattore V, il Fattore II, la metilen-tetraidrofolato reduttasi (MTHFR) e l’inibitore dell’attivatore del Plasminogeno di tipo 1 (PAI-1).
La Protrombina o Fattore II è il precursore inattivo della Trombina. Il gene comprende una regione 5’ UTR, 14 esoni con 13 introni e una regione 3’ UTR. Recentemente è stata identificata una comune mutazione genetica nella regione 3’ UTR associata ad elevati livelli di Protrombina e ad un aumentato rischio di trombosi venosa (Poort et al., 1996). Non è stata ancora chiaramente compresa l’importanza della transizione G-A al nucleotide 20210, ma numerosi studi hanno evidenziato che gli eterozigoti hanno livelli di Protrombina del 30% più alti rispetto ai soggetti wild type e hanno un rischio di trombosi venosa profonda 3-6 volte più alti della media della popolazione. Anche questa mutazione è rara nella popolazione non bianca, mentre nella popolazione bianca i portatori sono presenti in percentuale variabile tra lo 0,7 e il 4%. La mutazione G20210A sembra essere un importante fattore di rischio per la trombosi delle vene cerebrali. Tale mutazione inoltre sembra essere sinergistica con l’uso di contraccettivi orali.
Il Fattore V è una importante proteina presente nel sangue come pro-cofattore inattivo. Può essere attivato dalla Trombina dando luogo ad una molecola a due catene (Fattore Va) che funziona da cofattore del Fattore Xa nella conversione della Protrombina in Trombina. L’inattivazione del Fattore Va si realizza mediante proteolisi selettiva in posizione Arg306, Arg506, and Arg679 della catena pesante, da parte della proteina C attiva (APC).
L’ipotesi è che la trombosi possa essere causata da una moltitudine di mutazioni genetiche a livello di siti critici della proteina del Fattore V.
Una transizione G-A nell’esone 10 del gene del Fattore V determina la sostituzione dell’Arginina in posizione 506 con la Glutammina. Questa forma mutata del Fattore V è conosciuta come Fattore V Leiden ed è resistente all’inattivazione da parte dell’APC. Tale Fattore V Leiden attivato non viene idrolizzato dalla APC e viene quindi chiamato APC-resistente (Bertina et al., 1994). La presenza di portatori del Fattore V Leiden nella popolazione bianca varia dal 2 al 15%. Tale mutazione è estremamente rara in altre razze. Gli eterozigoti per il Fattore V Leiden invece presentano un aumento del rischio di trombosi venosa profonda di 7 volte rispetto alla popolazione normale, mentre per gli omozigoti tale rischio è di ben 80 volte più alto.
L’aplotipo HR2 del Fattore V comprende un polimorfismo (A4070G) nell’esone 13 del Fattore V sostituendo una Istidina (allele R1) con una Arginina (allele R2) nella posizione 1299 del dominio B del Fattore V (H1299R). Diversi studi mirati alla valutazione di una sua associazione con il fenotipo APC-resistance e con fenomeni trombotici hanno riconosciuto HR2 come un fattore di rischio protrombotico confermabile da un significativo abbassamento dei valori di APC-ratio in vitro e da un aumentato rischio protrombotico in quei soggetti che ereditavano in trans l’aplotipo HR2 e la mutazione Fattore V Leiden. Inoltre, soggetti con l’aplotipo HR2 hanno un aumento relativo della isoforma più trombogenica e glicosilata del Fattore V (Gemmati et al., 1999).
L’iperomocisteinemia è stata identificata come fattore di rischio cerebrovascolare, per il sistema vascolare periferico e le patologie delle coronarie. Un aumento del livello della omocisteina plasmatica può essere determinato da alterazioni genetiche o correlate alla dieta nei processi di trans-sulfurazione o re-metilazione nel metabolismo dell’omocisteina. La 5-10 metilen-tetraidrofolato reduttasi (MTHFR) catalizza la riduzione del 5-10 metilen-tetraidrofolato a 5 metilen-tetraidrofolato.
È stata evidenziata una riduzione dell’attività della MTHFR in pazienti con patologie delle arterie coronariche e periferiche.
La mutazione C677T nella MTHFR costituisce il più comune difetto ereditario del metabolismo dell’omocisteina. La sostituzione di una Alanina con una Valina in posizione 223 rende l’enzima termolabile diminuendone l’attività specifica ed instaurando la condizione di iperomocisteinemia soprattutto in condizioni di bassi livelli di folato (Gemmati et al., 1999).
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Un’altra mutazione individuata nella MTHFR è A1298C che risulta anch’essa correlata ad una riduzione dell’attività enzimatica.
L’inibitore dell’attivatore del Plasminogeno di tipo 1 (PAI-1) è una glicoproteina che funge da inibitore del processo di attivazione del Plasminogeno nel sangue ed ha un ruolo chiave nella formazione di trombi stabili. Una elevata concentrazione di PAI-1 nel plasma è associata a trombosi venosa ed arteriosa, disturbi coronarici ed infarto del miocardio.
A livello della regione promotore del gene PAI-1 è presente un polimorfismo (4G/5G) relativo ad una delezione di una G in posizione 675 dal sito di inizio del promoter. L’allele 4G può legare solo enhancers di trascrizione, mentre il 5G interagisce con enhancers e suppressors; questo si traduce in un più basso livello di trascrizione in presenza dell’allele 5G. Numerosi studi hanno dimostrato che soggetti portatori dell’allele 4G in omozigosi hanno livelli plasmatici di PAI-1 più alti del 25% rispetto ai soggetti 5G in omozigosi, con conseguente rischio di malattie coronariche, e nelle donne in gravidanza aumentato rischio di preeclampsia (Dawson, 1993).
La presenza di mutazioni multiple può avere effetti sinergici: è di estremo vantaggio quindi la possibilità di determinare simultaneamente più mutazioni.

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